ELISA的操作步骤

今天讲一下ELISA的操作步骤。

1.包扎工艺(注意作空白对照、阴性对照)：

使用的抗原以稀释液稀释至适当浓度(通常要求的抗原包被量是20-200微克/孔)，每个孔抗原加100μl，置于37℃，4h，或4℃，24h；除去孔内的液体.(为了避免蒸发，纸板上盖着纸板或将纸板平放在金属湿箱内，并置于湿纱布下)

2.酶标封闭反应孔：

5%小牛血清置37℃封闭40min.当封闭时，将封闭液灌入反应孔，并除去每个孔内的气泡，在封闭结束后用洗涤剂通孔冲洗3次，每次3min。

清洗方法：将反应液从孔中吸干，将清洗液注入板孔，放置2min，轻轻摇晃，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干。洗过三次。

3.加入检测样品(确定适当的浓度梯度)：

检验时一般采用1:50-1:400稀释，应用较大的稀释量进行，一般保证样品吸取量>20μl。

在酶标反应孔内加入稀释试样，在37℃40-60min处放置至少一个双孔，在每个样品孔内放置至少一个双孔，放置在37℃40-60min内。

4.酶标记抗体的加入：

ELISA：酶结合物提供商提供的参考工作稀释度为.37℃，30-60min之间.短于30min，通常结果不稳定.每孔100μl.在清洗之前先清洗。

5.加入液体底物(现配)：

TMB-双氧水尿素溶液，OPD-双氧水底物-液相体系次之。

基质添加量：每孔100μl，置37℃避光3-5分钟，加入终止液显色。

6.终止应对：

在终止反应中，每孔加入终止液50μl,20min内测定结果。

7.判决结果：

OPD显色后采用492nm波长，测得TMB反应产物需要450nm波长.检测时必须先做空白孔系统调零.用测定样品孔吸收值与一组阴性样品测孔的比值(P/N)表示，P/N大于2时，即为抗体的效价.(值的大小取决于特定检测要求.)

以上就是ELISA的相关内容了，谢谢阅读！